[00883210]猪圆环病毒检测技术研究

主要研究开发内容：1、从收集病料中分离鉴定了20株猪2型圆环病毒(PCV2)，用有限稀释克隆技术纯化了分离的病毒。2、测定了所有纯化PCV2毒株的全基因组序列，遗传进化分析证明中国流行的PCV2为2b基因型中的1A和1B型。3、开发了PCV1、PCV2的Cap和Rep蛋白原核表达系统，建立了基因工程技术制备工艺。4、以小鼠为模型，研究了PCV2Cap蛋白、Rep蛋白、ORF3和ORF4编码蛋白的免疫原性，证明了PCV2的Cap蛋白具有优良的免疫原性，Rep蛋白、ORF3和ORF4编码蛋白对Cap蛋白的负调控作用。5、筛选获得了分泌抗PCV1、PCV2的Rep和Cap蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株；鉴定出针对PCV1、PCV2的B细胞线性抗原表位，建立了PCV1和PCV2鉴别检测试纸条技术；6、研制出了猪圆环病毒2Cap蛋白抗体ELISA检测试剂盒并产业化生产；7、建立了PCV2的高通量病原荧光PCR检测技术。解决的主要技术问题1、揭示了PCV2的Rep蛋白、ORF3蛋白对Cap蛋白诱导机体免疫应答的负调节作用；2、解决了PCV2Cap蛋白可溶性表达的技术难题；3、解决了PCV1和PCV2感染鉴别诊断的技术难题；4、解决了抗体检测技术依赖病毒制备的技术难题。技术创新点与创新程度1、在国际上首次证明了PCV2编码的Rep蛋白、ORF3和ORF4蛋白对Cap蛋白诱导机体免疫应答的负调节作用；2、在国际上首次实现了PCV2Cap蛋白在原核表达系统中的可溶性表达；3、在国际上首次建立了PCV1和PCV2鉴别检测技术；4、在国际上首次利用基因工程表达的可溶性Cap蛋白研制了PCV2抗体ELISA检测试剂盒。技术经济指标国家二类新兽药注册证书1个、国家转基因生物安全证书1个、农业部批准的生产文号1个；授权实用新型专利2项；发表SCI论文5篇、中文论文4篇。推动科技进步的作用1、PCV2Rep蛋白、ORF3和ORF4对Cap蛋白免疫原性负调控作用的首次证明，从理论上为PCV2亚单位疫苗、核酸疫苗等新型疫苗的研究与开发提供了理论基础。2、PCV2的Cap蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的技术突破，促进和加快了PCV2基因工程亚单位疫苗的研发进程。3、针对PCV编码蛋白的系列单克隆抗体研制成功，促进了猪圆环病毒病鉴别诊断技术的发展。4、猪圆环病毒2抗体ELISA技术的开发成功，为猪圆环病毒病的疾病诊断、疫苗免疫效果的评估和流行病学调查提供了技术平台。成果转化价值与社会经济效益猪圆环病毒2-dCap-ELISA抗体检测试剂盒获国家新兽药注册证书、国家批准生产文号，已转让瑞普(保定)生物药业有限公司商业化生产。鉴别PCV感染的单克隆抗体技术已被美国葛兰素史克(GSK)公司采用。