[00835826]耐高温葡聚糖酶体外定向进化及耐热机理的研究

该课题以大肠杆菌为宿主，以Bacillus subtilis ZJF-1A5 beta-葡聚糖酶基因为起始基因，通过定向进化策略和高通量筛选手段获得了EGs1和EGs2两株热稳定性突变体，其葡聚糖酶基因分别有四个和五个氨基酸替换，这些氨基酸替换使EGs1和EGs2突变酶的Tm值分别比野生酶的Tm值（62.5℃）提高了3℃和5℃，达到了65.5℃和67.5℃。突变酶的最适反应温度也提高了5℃。两个突变酶对地衣多糖的水解能力分别被提高了28%和降低了21.6%，对地衣多糖亲和力无明显改变。在酶的最适pH值上，野生酶和EGs1突变酶为6.5，而EGs2突变酶为7.0。在酶的pH值适应性方面，野生型和突变型葡聚糖酶都有较宽pH适应范围，在pH 6.0-8.5范围内放置48h，保留80％以上的酶活力。这一结果说明采用定向进化技术有效地提高了酶的热稳定性。本课题取得的其他研究结果有：建立了高通量筛选耐高温葡聚糖酶的方法；EGs1和EGs2突变株传代50次后仍保持遗传稳定性；优化了EGs2产酶发酵条件；筛选并优化出提高葡聚糖酶热稳定性的复合保护剂；估算了热稳定性葡聚糖酶的储藏寿命。