[00805377]免疫磁珠技术检测孢子丝菌病血清抗体方法的建立

该项目“免疫磁珠技术检测孢子丝菌病血清抗体方法的建立”(编号200705139)为省科技厅资助的引导项目，属应用基础研究，2007年1月开始进行。项目的应用领域为临床医学和真菌学，可以用于临床上快速检验孢子丝菌病血清抗体，作为流行病学调研工具或用于基础研究。基本原理为：机体对真菌的免疫主要是细胞免疫，但是发生深部真菌感染后，仍然可以建立特异性的体液免疫，并且这种特异性抗体能被ELISA等方法检测出来。但是申克孢子丝菌中同时具有高抗原性和高特异性的物质较少，且由于厚而坚韧的细胞壁的保护，抗原分离难度较大。申克孢子丝菌细胞壁中的鼠李甘露糖甙(cell wall peptido-rhamnomannan，CWPR)，是一种孢子丝菌特异性抗原。将申克孢子丝菌于37℃下传代培养使之转化为酵母相，将获得的孢子经过高压灭菌后使用液氮研磨破壁，采用Cetavlon/无水乙醇沉淀法对CWPR进行粗提，再用刀豆蛋白琼脂糖(Con A-Sepharose 4B)亲和层析法获得纯化的CWPR成分即申克氏孢子丝菌刀豆蛋白A结合片段(SsCBF)。采用色谱法检测O联寡糖来鉴定分离到的CWPR。使用获得的SsCBF抗原免疫BALB/c健康小鼠，取加强免疫后的小鼠的脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合，获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。筛选出阳性单抗后，对杂交瘤细胞进行扩大培养，诱导BALB/c小鼠腹水单抗，从而获得抗SsCBF单克隆抗体。将此杂交瘤细胞株冻存即可备用于大量生产单抗。使用获得的单克隆抗体包被免疫磁珠，再将分离纯化的SsCBF与包被好的磁珠共同孵育获得磁珠-单抗-抗原复合体，将患者的血清加入，如果血清中含有抗SsCBF抗体，将与磁珠表面上的抗原特异性结合，在磁场作用下析出，聚集物经振摇即产生肉眼可见的凝集颗粒，阴性血清则没有凝集颗粒。最后，利用实验过程中建立的大样本量孢子丝菌病患者资料和标本库提供患者血清、阴性对照血清和临床资料进行特异性和敏感性试验。性能指标：该研究的主要性能指标为申克孢子丝菌特异性单克隆抗体，能够分泌申克孢子丝菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备的免疫磁珠检验孢子丝菌病患者血清抗体的特异性和敏感性。实际性能指标：检测200份患者血清和50份阴性对照血清，敏感性90.5%，特异性96.0%，准确性91.6%。