[00722991]一种灵敏和特异的基于荧光定量PCR的miRNA检测新方法S-Poly(T)法

MicroRNAs(miRNAs)是一类单链非编码小RNA，在转录后水平涮控基因的表达。准确、高效的miRNA的表达谱分析，对于揭示miRNA的调控功能，寻找细胞组织和疾病特异的miRNA标志物具有重要的意义。该成果发明了一种新的miRNA定量检测新方法S-Poly(T)法。与当前用于miRNA检测的Poly(A)法和Stem-loop法相比，S-Poly(T)法具有更高的灵敏性和特异性。该法的原理是：使用由oligo(dT)和数个与miRNA3’末端互补碱基组成的S-Poly(T)引物对miRNA进行反转录，然后用特异上游引物、通用下游引物、通用Tmqman探针对miRNA进行qRT-PCR检测。大量的数据表明，与传统方法相比，新方法的灵敏性提高4-90倍(平均提高10倍)。同时，S-Poly(T)法具有极高的特异性，能区分检测只有一个碱基区别的miRNA，比如let-7家族miRNA。使用新方法，课题组对缺氧条件下人肺动脉平滑肌细胞的miRNA表达谱进行了高通量检测，发现了9个显著差异的miRNA(5个上调、4个上调)。同时，利用该方法，课题组绘制了正常人血清miRNA表达谱，将可检测的血清miRNA数目从报道的300多个提高到500多个；并从30例肺动脉高压患者血清中发现了数个异常表达的miRNA，为开发基于血清miRNA标志物的肺动脉高压早期诊断方法打下了良好基础。该方法在miRNA准确定量，寻找miRNA标志物而开发无创、灵敏的重大疾病早期诊断方法方面，具有光明的应用前景。技术创新：使用该发明的检测miRNA的方法，具有以下几大优点：1.S-Poly(T)法检测miRNA的灵敏性显著提高。S-Poly(T)法扩增miRNA的最低模板量为0.01pg总RNA；扩增线性范围宽，能覆盖7个数量级(0.01pg-10ng总RNA)，相关系数R值高于0.99。S-Poly(T)法与Poly(A)和Stem-loop法相比，S-Poly(T)法的灵敏性提高4-90倍(平均提高10倍)。2.S-Poly(T)法检测miRNA的特异性显著提高。S-Poly(T)法具有极高的特异性，能区分检测只有一个碱基区别的miRNA，比如let-7家族miRNA。同时，该法能区分成熟miRNA与pri-miRNA和pre-miRNA。3.操作简单，能进行高通量分析：S-Poly(T)法在cDNA合成过程中，能同时将不同miRNA的反转录引物混合后进行多个miRNA的eDNA合成，这样不仅能有效降低因加样所导致的误差，而且有利于高通量分析。4.检测成本低：S-Poly(T)法使用通用Taqman探针，大大降低了检测成本，因此更加适合推广。专利情况：发明专利，一种检测miRNA的方法及引物及其应用(申请号201110101438.5)。市场前景及应用领域：应用领域：恶性肿瘤等重大疾病早期诊断和预后的应用。市场前景：(1)预期实现的经济指标：预期miRNA检测试剂盒年销售量达12,000盒，年销售额为2400万元，可实现年利税758万元。(2)预期实现社会和经济效益(以癌症为例)。有助于及早对肿瘤进行诊断，指导正确用药，延迟或抑制肿瘤的发展，给中国众多的肿瘤患者带来福音，产生巨大的社会效益。除了癌症，该成果还可以用于心脑血管疾病、呼吸系统疾病、老年痴呆症等重大疾病的早期诊断和预后。(3)该成果对产业的带动和提升作用。将对中国的肿瘤等重大疾病诊断产生巨大的影响，填补了国内同类产品空白，也标志着中国的miRNA检测技术进入了国际领先行列，提升了中国miRNA研究在国际上的学术地位，将吸引国内更多的科研机构和企业进入miRNA研究领域。促进整个产业的快速发展，造福广大患者。合作方式：风险投资，技术转让，合作开发。