[00326607]四氢嘧啶生物合成的研究

四氢嘧啶作为一种对蛋白、核酸、生物膜及整个细胞的保护剂和稳定剂以及渗透压平衡物质，越来越多的受到人们的关注。

但是其合成途径仅存在于一些中度嗜盐微生物中，生产工艺复杂、成本高、产量低。

本研究通过在大肠杆菌中引入四氢嘧啶合成途径构建出一株不依赖盐激诱导的四氢嘧啶工程菌，并通过系统代谢改造提高了四氢嘧啶产率。

首先以pTrc99a质粒为载体克隆Halomonas elongata中四氢嘧啶合成所需关键基因ectABC到大肠杆菌W3110，摇瓶发酵结果表明在大肠杆菌中重构四氢嘧啶合成途径成功，发酵液中四氢嘧啶积累量分别为4.88 g/L。

根据大肠杆菌对遗传密码的偏好性对ectABC基因簇做密码子优化后，摇瓶发酵结果显示四氢嘧啶积累量下降了84.6%，并未达到预期的优化效果。

其次分别通过敲除lysA和thrA基因以阻断、弱化竞争抑制支路构建了W3110（pTrECT， ？lysA）和W3110（pTrECT， ？thrA）两株工程菌，摇瓶发酵结果显示发酵液中四氢嘧啶积累量分别提高49.6%和109.1%。

而当lysA和thrA被同时敲除后四氢嘧啶积累量下降了38.9%。

之后利用统计学方法对工程菌发酵培养基进行系统优化，优化后摇瓶发酵四氢嘧啶产量可以达到13.52 g/L。

以葡萄糖为单一碳源，经5 L发酵罐分批补料发酵最终发酵液中四氢嘧啶积累量达到25.14 g/L，生产效率为0.84 g·L-1·h-1，单位菌体产率可达到0.8 g/g DCW，葡萄糖转化率为10.7%。

最后设计提取工艺路线，优化提取工艺条件，获得了四氢嘧啶晶体，提取收率为70.3%。

经液相检测，产品纯度为99.7%，纯度优于市售的德国默克公司生产的四氢嘧啶产品。