[01563713]耐高温α-淀粉酶基因工程菌构建、筛选及液体发酵工艺研究

“耐高温α-淀粉酶基因工程菌构建、筛选及液体发酵工艺研究（20090589）”是2009年经吉林省科技厅审批通过正式立项研究的。 该项目利用分子生物学技术,利用克隆得到地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶基因,构建高效表达载体,获得了高效表达的基因工程菌,其表达产物的稳定性好、活力高,耐受的温度高;对表达产物的性质、酶活力及发酵工艺条件进行优化,通过分子生物学技术克服了传统方法生产耐高温α-淀粉酶的制约因素,进一步简化生产条件并提高酶的活性,研究开发了具有我国自主知识产权的产酶新菌种和耐高温α-淀粉酶液体发酵生产新配方和新工艺。 利用基因工程菌生产耐高温α-淀粉酶具有工艺简单、产品不易污染,能耗低,产出率高等优点。项目成果进一步推广应用,将会极大地推动我国淀粉酶新产品的更新换代,替代进口产品,尽快改变我国酶制剂行业全采用天然菌种、发酵水平低的落后现状,促进我省乃至全国玉米深加工产业及相关产业的纵深发展。 项目主要研究成果及技术指标： 1、利用现代分子生物学技术成功构建并获得了高效表达的耐高温α-淀粉酶基因工程菌,其表达产物的稳定性好、活力高,耐受的温度高,为我国获得具有自主知识产权的新型产酶基因工程菌填补了空白。 2、利用基因工程菌生产表达的酶蛋白采用超滤、非变性垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳和淀粉—碘染色法相结合纯化,DEAE-纤维素层析法纯化等,得到了纯度较高的酶蛋白。 蛋白的等电点分别为5.5和5.8,最适作用温度为90℃,最适作用pH值为6.0-6.5,稳定pH值范围为4.0-11.5,100℃下保温30min酶活力分别保留12%和18%。 3、利用优化得到的基因工程菌进行了耐高温α-淀粉酶的摇瓶发酵和5 L发酵罐的高密度发酵生产,发酵培养基配方及工艺条件优化,最佳发酵工艺条件为：30℃,200 rpm/min,96h,发酵培养基为BMMY,甲醇添加量0.5%,酶活分别为217.2U/mL和2037.8 U/mL,原核和真核工程菌酶的活力分别达到670活力单位和2100活力单位,较原始菌株分别提高14倍和44倍。酶产品经过检测,主要卫生指标达到了QB/T 2306-97标准。 本项目的完成在自主构建产α-淀粉酶基因工程菌方面有所突破,缩小了在该领域与国外的差距。项目创新点如下： （1）构建了具有我国自主知识产权的耐高温α-淀粉酶基因工程菌。 （2）对基因工程菌液体发酵生产耐高温α-淀粉酶的新配方和新工艺进行了研究。 此技术发酵酶活力与回收率高,酶的提纯工艺简单,不易污染,生产过程易于控制,产品成本低,有利于工业化生产。 耐高温淀粉酶产品是我国生物工程主攻项目,该产品能替代进口酶制剂的产品,发展前景广阔。产品广泛应用于淀粉、酒精、啤酒、味精、酿造、葡萄糖、饴糖、纺织等行业上,具有重要推广价值和应用前景。 下一步推广应用采取的主要措施： 1、利用筛选出的高产高效基因工程菌进行发酵工艺的扩大生产试验,通过50 L、100 L以及更大的发酵罐的高密度发酵试验,深入研究发酵工艺条件,进一步提高酶活性和酶产率,为工业化规模生产提供技术数据。 2、与相关企业合作,深入研究、试验工业化生产耐高温α-淀粉酶的新工艺,努力实现具有我国自主知识产权的α-耐高温淀粉酶的工业化生产,通过进一步的完善以达到在发酵工业生产中代替进口酶制剂,逐步改变依赖进口工艺技术和菌种生产以及以来进口产品的现状。 3、利用基因工程菌耐高温α-淀粉酶发酵生产工艺成熟后,申请相关国家专利,保护我国自主知识产权。