[01537573]富含杂合抗菌肽酵母饲料的研制与开发

1、课题来源与背景：抗菌肽是一类普遍存在于生物体内的天然免疫分子,具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤且不易形成耐药性和无药物残留等多种生物学特点。随着抗生素在畜牧养殖业中的广泛应用,抗生素在畜禽产品中的残留、细菌耐药性及环境污染等问题日益严重。针对这一现状,本课题进行了含杂合抗菌肽酵母饲料的研制。 2、技术原理及性能指标：以杂合抗菌肽分子设计原理为基础,应用生物信息学和分子生物学的实验技术与方法,将家蝇抗菌肽Cec MD和中国林蛙抗菌肽Chensirin作为母体肽,设计出3条可在毕赤酵母体系中表达后具有抗菌潜力的杂合肽,将其命名为CC29、CC30和CC34（1）。通过表达载体pGAPZαA构建重组表达载体后,转化到毕赤酵母SMD1168中,利用高浓度Zeocin进行筛选,得到高抗性基因工程菌pGAPZαA/ CC29、pGAPZαA/ CC30、pGAPZαA/ CC34-1和pGAPZαA/ CC34。筛选出两株多拷贝重组工程菌,并重新分别命名为CC29-8、CC30和CC34-1。在YPD培养基中进行表达,其表达产物进行纯化后,进行杂合抗菌肽的抑菌活性和溶血活性的初步研究,为后续杂合抗菌肽的大规模发酵奠定基础,同时也为生产饲料添加剂提供资源。 3、技术的创造性与先进性：应用生物信息学技术、基因工程技术设计杂合抗菌肽CC29、CC34-1基因,通过SOEing PCR技术对杂合抗菌肽进行基因扩增,构建CC29、CC30、CC34-1的pMD18-T阳性重组质粒和pGAPZαA表达载体并成功转入毕赤酵母菌中表达;应用生物发酵工程技术,对富含抗菌肽毕赤酵母基因工程菌的生长规律进行研究,确定了最佳培养基组成与培养条件,通过优化补料策略、溶氧水平与发酵方式等确立适合工业化生产的富含抗菌肽的益生菌饲料生产的最佳发酵工艺;通过动物试验验证其促生长和提高免疫性作用。 4、技术的成熟程度,适用范围和安全性：本研究在前期工作基础上,以分泌型的益生菌-毕赤酵母菌为载体,用基因工程技术和生物发酵技术生产具有较高的抑菌活性及较低的溶血活性、适合工业化生产的富含抗菌肽的益生菌饲料,可以同时发挥毕赤酵母菌和抗菌肽的双重益生作用。本项目研究成果可在饲料工业和动物养殖业中推广应用。 5、应用情况及存在的问题：本项目由于资金不足和研究时间相对较短的问题,推广面积有限。今后需进一步完善规模化生产工艺,加强产品宣传,加强产学研结合,通过成果转化,进一步扩大推广应用面积。 6、历年获奖情况：项目实施期间,发表学术论文12篇,会议论文4篇,申报发明专利1项。 7、成果简介： 一是完成Cec Md-Cec Rca肽的优化设计及在酵母细胞中的表达与表达条件的优化：以杂合抗菌肽分子设计原理为基础,设计出可在毕赤酵母体系中表达的杂合肽,分别为：CC22、CC28、CC29、CC30、CC34和CC34（1）,并且通过其理化特性参数测定、结构预测、两亲性和电荷分布预测可知：新设计出的抗菌肽中CC29的电荷数最高,都具有α-螺旋结构,且显示出较好的两亲性,6条杂合抗菌肽均具有成为优秀抗菌肽的潜力。通过重叠PCR方法合成6条杂合抗菌肽基因,基因大小分别是：94bp、112 bp、115 bp、118 bp、130 bp、和130 bp。构建了杂合抗菌肽基因的表达载体pGAPZαA /CC22、pGAPZαA/CC28、pGAPZαA /CC29、pGAPZαA /CC30、pGAPZαA /CC34（1）和pGAPZαA /CC34,构建CC29、CC30、CC34-1的pMD18-T阳性重组质粒和pGAPZαA表达载体并成功转入毕赤酵母菌种表达,表达效果较好。 二是完成富含杂合抗菌肽的酵母发酵条件的筛选和优化：应用生物发酵工程技术,对富含杂合抗菌肽的酵母基因工程菌的生长规律进行研究,确定生产富含抗菌肽的益生菌饲料生产的最佳发酵工艺：经优化后的培养基配方：葡萄糖40 g/L、（NH4）2SO4 12.5g/L、CaSO4·2H2O 0.94 g/L 、MgSO4·7H2O 14.9 g/L、磷酸钾缓冲液120 mL/L、酵母提取物10 g/L。最佳培养条件：接种量为10%、培养基初始pH=6、温度为30℃、转速为220 rpm/min,在此条件下,两种杂合肽的表达量分别为51.47 mg/L和46.88 mg/L。通过中试发酵确定补料工艺采用恒速流加补料,培养基中添加0.1%的酪蛋白水解物可提高菌体生物量,杂合抗菌肽的表达量分别为80.6 mg/L和74.58 mg/L,发酵后的表达产物经过加热处理、酸碱处理以及蛋白酶水解后仍然具有一定的生物活性。 三是完成CecMd、CC29、CC34抗菌肽制剂对肉仔鸡生长性能、营养物质利用和免疫的影响研究：以不同抗菌肽制剂为试验材料,在AA肉仔鸡日粮中添加三种抗菌肽制剂,研究其对1～6周龄AA肉仔鸡生产性能、屠宰性能以及营养物质代谢率的影响,结果在日粮中添加不同抗菌肽制剂均能够改善AA肉鸡的生长性能,都很好的提高肉仔鸡的平均日增重。有效降低肉仔鸡的料重比,在干物质、粗脂肪、磷代谢率方面有较明显的提高,对屠宰性能影响较小。