[01509557]多元重建分析技术的引进及其用于构建生物质酶高产菌株的合作研究

1．项目来源与背景 最新文献显示在生物质能源的开发和利用研究中,现代化学计量学方法的应用还处于开发阶段。利用多元重建熵最小化分析技术筛选和构建高活性生物质能源相关菌株/酶的研究国内外尚无报导。为此,本项目针对生物质能源相关菌株/酶筛选和构建的关键共性问题,开展多元重建熵最小化分析技术的引进及其用于构建生物质酶高产菌株的合作研究,引进新加坡ChemoPower科技公司的MREM分析技术,消化吸收后再创新,开拓现代化学计量法在生物质能源领域中的应用。 项目“多元重建分析技术的引进及其用于构建生物质酶高产菌株的合作研究”是2013年4月16日桂财教[2013]47号文件下达的广西科学研究与技术开发计划项目（以下简称本项目）。为顺利完成本项目,广西科学院与广西壮族自治区科学技术厅订立了项目合同,合同编号：桂科合1347004-1。项目实施期限：2013年01月至2015年12月。 2．研究目的与意义 在双方现有技术的基础上,针对生物质能源相关菌株/酶筛选和构建的关键共性问题,开展多元重建熵最小化分析技术的引进及其用于构建生物质酶高产菌株的合作研究。引进新加坡ChemoPower科技公司的MREM分析技术,与色谱/质谱联用,分析生物质能源相关的产酶菌株,开发快速定性、定量处理混合物数据、获取成分和浓度信息的新方法,在此基础上建立有关菌株/酶的数据库,进行高通量的酶筛选试验,加速选育和构建高产高活性的产酶菌株,促进广西非粮生物质能源的产业发展。 3．主要论点与论据 按照合同书规定的任务要求开展了创新性科学技术合作研究,引进新加坡ChemoPower科技公司的多元重建熵最小化（MREM）分析技术,开发其在筛选和构建高活性生物质能源相关菌株/酶的应用。 ⑴ 开发MREM分析技术软件 根据广西科学院拥有的仪器条件编写了MREM分析技术软件,编写了MREM软件使用说明,包括：主程序、MREM程序集主结构、ASCII数据文件读取、NetCDF格式数据读取操作、从Agilent导出数据、结果读取查看等;研发各种算法处理高分辨率的数据,进行编程和界面优化,增加了软件的一些新功能,研发了MREM软件的自动版本;开发快速处理混合物数据、获取成分和浓度信息的新方法,并对MREM软件和AMDIS软件（安捷伦的自动质谱图解卷积和鉴定系统）进行比较分析。 ⑵ 开展典型菌株的红外谱图分析 选择和生物质能源密切相关的典型菌株进行红外谱图分析,比较不同菌株的特性谱图,寻找这些谱图的差异,分析这些差异和菌株特性、菌株内含的水解酶的特性及相互关系。在此基础上,探索菌株红外谱图数据库的建立。 ⑶ 进行微生物发酵产物GC-MS实验测试 摸索可用于联合检测生物质能源相关菌株/酶代谢产物的实验条件,采用不同的方法对发酵液进行预处理,然后进行GC-MS分析,从而得到其中尽可能多的组分信息。建立利用气质联用分析微生物代谢产物的技术,以现代化学计量法为辅助手段开展菌株/酶代谢产物的定性定量研究。 ⑷ 实验数据的分析和整合 对代谢组数据集进行主成分分析,比较各代谢物的效果,通过加权相关网络分析识别代谢模块,了解不同菌株的代谢途径。收集和整理实验数据,分析和整合实验结果,建立了1个分析生物质能源相关产酶菌株的简单数据库,包括10个菌株的基本特征、酶学活性、红外光谱、质谱等数据的整合信息。 ⑸ 高产菌株的理论研究 分析纤维素酶的分泌途径、信号肽,分析淀粉酶和纤维素酶的系统进化,分析细菌Sec分泌系统中不同亚单位的系统进化,为筛选高活性产酶菌株提供理论依据。 ⑹ 高产菌株/酶的筛选和构建 ① 高产、高活性产纤维素酶菌株的筛选 找到一株对纤维素具有水解能力的放线菌,属于内切纤维素酶,从这株放线菌中克隆、表达并酶学鉴定了cel5A基因,发现这个基因在序列上与报道的基因或在数据库中记录的基因没有任何同源性,该酶对羧甲基纤维素具有高的酶活。 ② 丁醇耐受菌的代谢变化的分析 针对生物质能源中丁醇的发酵问题,展开对人工改造丁醇发酵途径宿主菌的丁醇耐受能力分析。利用GC-MS对不同丁醇胁迫条件下,宿主菌应对环境的代谢变化,分析不同的代谢流,寻找和丁醇发酵耐受相关的酶基因。 ③ 不同来源的环糊精水解酶的分析 为了实现对支链淀粉的彻底水解,分析了降解淀粉类物质的水解酶对支链淀粉的水解能力,不同来源的环糊精水解酶可以提供糖基水解酶家族13对支链淀粉水解差异的蛋白质结构基础,为开发新的支链淀粉水解酶提供新的研究路径。 ④ 高产氢气菌株的研究 针对生物质能源中纤维素的利用,以及新一代能源——氢气的研发问题,开展高产氢气菌株的分析。对资源库中保存的高产菌株进行筛选,并用GC-MS对这些菌株利用不同碳源情况下的产氢气情况进行分析,利用现代化学计量法对这些数据进行解构和对比,寻找关键的酶基因。 ⑺ 技术成果 ①、申请专利 项目实施期间,申请国家发明专利1项：一株阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）gxas h-1及其应用（专利申请号：201410522297）,专利进入实质审查阶段。 ②、发表学术论文 本项目共发表学术论文9篇,其中国外SCI刊物发表5篇,国内刊物发表4篇;在国内外学术会议发表论文15篇。 4．解决的关键技术问题和创新点 ⑴ 解决的关键技术问题 ①、利用MREM技术快速处理生物质能源相关菌株/酶代谢混合物的方法问题; ②、加快筛选和构建高产、高活性生物质能源相关菌株/酶的技术问题。 ⑵ 创新点 ①、成功引进了新加坡ChemoPower科技公司的MREM分析技术,经过消化吸收后再创新,开发了MREM技术在分析生物质能源相关菌株/酶代谢混合物的应用,提供了快速处理混合物的新方法; ②、开拓了MREM化学计量法在筛选和构建生物质能源相关产酶菌株的应用,实现了利用现代化学计量法为辅助手段筛选高产、高活性生物质能源相关菌株/酶的技术突破,开发了一种通用、快速的生物质能源相关菌株/酶的筛选方法,用于构建高产、高活性的产酶菌株。 5．社会效益和存在问题 ⑴ 社会效益 通过本项目的实施,成功引进了新加坡ChemoPower科技公司的MREM分析技术,经过消化吸收后再创新,建立了色谱?质谱联用检测生物质能源相关菌株/酶代谢产物的实验平台和快速处理混合物的分析平台,开拓了MREM化学计量法在筛选和构建生物质能源相关产酶菌株的应用,实现了利用现代化学计量法为辅助手段筛选高产、高活性生物质能源相关菌株/酶的技术突破。利用这种通用、快速的菌株/酶的筛选方法,将有助于加速高产、高活性的产酶菌株的筛选和构建,促进广西非粮生物质能源的产业发展。 ⑵ 存在问题 虽然研究人员在多元重建熵最小算法（MREM）和编程上耗费了较多时间,调整算法对仪器的适应性也耗费了不少精力,但是由于本项目实施时间有限,目前该算法仍然面临一些问题需要解决。例如：① 数据采样率、样品浓度等对分析结果的影响较大,需要优化适应性更加广泛的算法;② 代谢物有很多未知的组分,NIST谱库中尚未收录,采用MREM算法重构出来的组分需要用其他的方法进行定性分析和验证;③ 代谢物成分中有很多同分异构体和同系物,他们质谱碎片的相似度达到90%以上,MREM算法解析这类化合物的混合谱时往往效果较差,需要开发灵敏度更高的算法;④ 代谢物中存在许多沸点高、受热易分解的组分,这类物质无法使用气相色谱质谱法进行分析,需要用液相色谱质谱法去分析,但目前多元重建熵最小算法只能用于解析气相色谱质谱法得到的数据。