[01382044]盐生植物盐地碱蓬甜菜红素提取及纯化工艺研究

1、任务来源 山东省科技发展计划资助项目（2006GG2202067）2007.01～2009.12 盐生植物盐地碱蓬甜菜红素提取及纯化工艺研究 2、简要技术说明 本项目首次证明盐生植物盐地碱蓬体内的红色素是甜菜红素,其合成受到光照、温度、盐分等多种环境因子的影响,其中发芽期黑暗处理是诱导甜菜红素合成的最关键因素之一。在愈伤组织水平上,细胞分裂素TDZ和6-BA显著促进甜菜红素的积累;光质和光强度显著影响盐地碱蓬愈伤组织的生长和甜菜红素的积累,白光对甜菜红素的诱导效果最好。盐地碱蓬甜菜红素具有较强的体外清除氧自由基的能力。盐地碱蓬甜菜红素离体条件下对高温、强光、碱和氧化剂敏感,应该在低温、避光、酸性或者中性、避氧化剂等条件下存放和使用。 鉴于甜菜红素在食品、医药、日用化工等方面的广泛应用,我们又探讨了甜菜红素的提取、分离纯化工艺,成分结构及抗氧化活性等方面的研究,进行了稳定剂最佳配方的筛选和色素稳定性比较研究,并研究了其贮藏和应用的适宜条件。主要研究结果如下： 对叶片中甜菜红素的提取工艺进行了优化：浸提剂应选择pH5的去离子水;在材料研磨成粉末的情况下,不同浸提时间对提取效率无显著影响;在甜菜红素保持稳定的温度范围内,随着浸提温度的升高,提取率逐渐增大;利用高效液相色谱的方法,通过测定实现基线分离的甜菜素类成分在特征吸收波长550nm下的总峰面积,运用正交设计,对盐地碱蓬甜菜红素的提取工艺进行了初步研究。即在室温下,以60%乙醇水为提取溶剂,料液比1：20,超声浸提30分钟,浸提2次,可最大效率提取盐地碱蓬中的甜菜红素类成分。 为了扩大盐地碱蓬甜菜红素的应用范围,我们对甜菜红素的进一步分离纯化进行了研究,结果表明：用甲醇预提可以提高色素粉末的色价;用80%的甲醇进行多次提取,最后浓缩冻干得到的色素粉末3色价较高,达到了1.968;色素粉末3再经过Sephadex G-25凝胶柱层析后,所得的甜菜红素粉末8,其色价为3.536;甜菜红素粉末3,经过LH-20柱层析后,其收集液通过HPLC分析,初步推测盐地碱蓬甜菜红素的结构应为3种以上。为了弄清这三种成分,我们运用高效液相色谱及液相质谱联用技术首次确定了盐地碱蓬中甜菜红素的主要成分：Betanidin、CelosianinⅡ及其C15 异构体。运用DPPH法对盐地碱蓬的抗氧化能力进行了初步研究,表明：Betanidin和CelosianinⅡ在10μg/mL的抗氧化能力均比维生素C及芦丁高2倍多,但随着浓度的增加其抗氧化能力变化很小,这说明这两种物质在低浓度下已经达到了较高的水平,适合低浓度应用。 鉴于甜菜红素的不稳定性,我们筛选的最佳稳定剂为0.06%的维生素C+0.06%的苯甲酸钠+0.02%的L-抗坏血酸钠。加入稳定剂后,均可不同程度地提高色素对温度、光照、pH值、还原剂的耐受性,但色素对蔗糖、氧化剂的耐受性却未见提高。采用低温烘干的方式得到甜菜红素粉末,此法对甜菜红素的损失较小;在低温、避光的条件下,甜菜红素粉末的稳定性要更高一些;由于甜菜红素的不稳定性,因此应用时需谨慎,通过研究几种常见饮料添加甜菜红素后的稳定性,结果表明,白醋、白葡萄酒等均不适宜添加甜菜红素。 实验的结果已经超过预期目标：在盐地碱蓬整株水平和愈伤组织水平上成功的诱导出甜菜红素;成功地将甜菜红素进行了提取、分离和纯化,并且不断优化和改进分离、提取和纯化工艺;确定了盐地碱蓬甜菜红素的三种主要成分,分别是Betanidin、CelosianinⅡ及其C15 异构体,并验证了它们的抗氧化能力;筛选了甜菜红素的最佳稳定剂,同时采用低温烘干的方式得到甜菜红素粉末,此法对甜菜红素的损失较小。 3、性能指标 比较了盐地碱蓬不同部位甜菜红素的含量差异,确定了最佳取样部位为叶片。通过上述研究总结了提取方法和流程,对叶片中甜菜红素的提取工艺进行了优化：浸提剂应选择pH5的去离子水;在材料研磨成粉末的情况下,不同浸提时间对提取效率无显著影响;在甜菜红素保持稳定的温度范围内,随着浸提温度的升高,提取率逐渐增大;料液比以1：6左右为宜。经甲醇或乙醇预提,二者对甜菜红素的提取率无显著影响,但经甲醇预提去除的杂质较乙醇多,用甲醇预提可以提高色素粉末的色价;用80%的甲醇进行多次提取,最后浓缩冻干得到的色素粉末3色价较高,达到了1.968;色素粉末3再经过Sephadex G-25凝胶柱层析后,所得的甜菜红素粉末8,其色价为3.536。如果需要色价比高的甜菜红素和更纯的甜菜红素,可以经甲醇或乙醇预提,在水溶后真空冷冻干燥保存,但是,如果用于饮料、食品和化妆品则最好用乙醇预提,或者用pH5的去离子水提取真空冷冻干燥保存。 鉴于甜菜红素的不稳定性,我们筛选的最佳稳定剂为0.06%的维生素C+0.06%的苯甲酸钠+0.02%的L-抗坏血酸钠。加入稳定剂后,均可不同程度地提高色素对温度、光照、pH值、还原剂的耐受性,但色素对蔗糖、氧化剂的耐受性却未见提高。采用低温烘干的方式得到甜菜红素粉末,此法对甜菜红素的损失较小;在低温、避光的条件下,甜菜红素粉末的稳定性要更高一些;由于甜菜红素的不稳定性,因此应用时需谨慎,通过研究几种常见饮料添加甜菜红素后的稳定性,结果表明,白醋、白葡萄酒等均不适宜添加甜菜红素。 甜菜红素粉末3,经过LH-20柱层析后,其收集液通过HPLC分析,初步推测盐地碱蓬甜菜红素的结构应为3种以上。为了弄清这三种成分,我们运用高效液相色谱及液相质谱联用技术首次确定了盐地碱蓬中甜菜红素的主要成分：Betanidin、CelosianinⅡ及其C15 异构体。运用DPPH法对盐地碱蓬的抗氧化能力进行了初步研究,表明：Betanidin和CelosianinⅡ在10μg/mL的抗氧化能力均比维生素C及芦丁高,但随着浓度的增加其抗氧化能力变化很小,这说明这两种物质在低浓度下已经达到了较高的水平,适合低浓度应用。 4、特色与创新点 本项目主要特色： 1.本项目（与目前甜菜红素主要从甜菜和仙人掌提取相比）利用盐生植物盐地碱蓬提取甜菜红素,为开发利用重盐碱地形成新的产业链奠定了基础; 2.与甜菜相比,紫红色表型盐地碱蓬叶片成分比较简单,尤其是其总糖含量（0.21%）较甜菜含糖量（17%）要低很多,果胶含量也很低,所以,用pH5去离子水提取一次就可以,形成了满足不同需要的盐地碱蓬提取纯化甜菜红素工艺,方法简单、无污染、成本低廉; 3.确定了盐地碱蓬甜菜红素的三种主要成分,分别是Betanidin、CelosianinⅡ及其C15 异构体,并验证了它们的抗氧化能力,为进一步研究及开发利用这些从成分提供了依据; 4.全面系统研究了盐地碱蓬甜菜红素代谢的生理及分子机理,确定了影响甜菜红素积累的内外因素,为实现盐地碱蓬甜菜红素工业化生产奠定了基础。 本项目的主要创新点： 1.首次以天然状态下生长的盐生植物盐地碱蓬为原料提取甜菜红色素,对盐地碱蓬甜菜红素的提取分离纯化工艺及稳定剂进行了系统研究,提出了最佳的提取分离纯化工艺及稳定剂配方,原料无毒及提取剂无毒、无害、无污染,属于“绿色”产品,盐地碱蓬生长在滨海盐渍地区,生物量大,取样容易,成本廉价,为应用于食品、饮料和化妆品等工业奠定了基础; 2.首次发现潮间带生长的盐地碱蓬积累的色素为甜菜红素,进一步确定了盐地碱蓬甜菜红素中的三种成分Betanidin、CelosianinⅡ及其C15 异构体并证明了它们的抗氧化活性是Vc和芦丁的2～3倍,为进一步开发医药保健产品奠定了基础; 3.系统探讨了盐地碱蓬整株幼苗和愈伤组织中甜菜红素的含量受环境因子光、H2O2、Ca2+、温度和盐度等多种环境因素影响的生理和分子机制,确定了自然条件取样时间和部位,特别是获得了能够积累甜菜红素的愈伤组织,为工厂化生产盐地碱蓬甜菜红素提供了依据; 4.研究盐地碱蓬甜菜红素积累的生理及分子机理,克隆盐地碱蓬甜菜红素生物合成相关基因及启动子并探讨其作用机理（SsDODA,SsUGT）,为利用转基因技术生产甜菜红素提供了依据。