[01338571]道地药材土三七的抗癌成分筛选及成分分析实验研究

一、技术说明1.土三七（景天三七）中没食子酸和总酚酸含量测定考察不同溶剂对土三七中没食子酸和总酚酸提取的影响，没食子酸的含量测定选用高效液相色谱法，色谱条件为：流动相为甲醇—磷酸水溶液（pH 3.0）（90：10），检测波长271nm，流速1.0mL/min。总酚酸的分析采用分光光度法，以没食子酸为对照品，0.6％FeCl3-0.9％K3[Fe（CN）6]（1：0.9）混合溶液为显色剂，在720nm波长处进行定。2.土三七中多糖提取条件的优化及含量测定以水为溶剂，采取正交设计L9（34）考察了提取温度、提取时间及溶媒倍数等条件，对多糖提取的影响。并采用Sevege法对粗多糖进行去蛋白纯化。以葡萄糖为标准品，采用苯酚—浓硫酸法测定其多糖含量。3.土三七的组织栽培，并比较野生型和栽培型土三七药材中总酚酸的含量选择野生土三七植株的幼嫩叶片为外植体，经消毒、接种、培养，后经增殖培养、壮苗培养和炼苗过程，移栽于经灭菌的珍珠岩和泥碳土混合基质的营养体中，待组培苗生长健壮，移栽室外田间，进入常规栽培管理。秋、春季采集。对野生型和人工栽培型土三七药材中总酚酸的含量进行分析，并通过统计学处理，分析两者是否有显著性差异。4.土三七对食管癌细胞的影响。4.1 土三七不同提取液的制备粉碎干燥的土三七，分别用95％乙醇和蒸馏水提取，将乙醇液浓缩干燥得浸膏，配成水溶液，同水提取液一起用于食管癌细胞培养。4.2 对食管癌细胞（Ec-109）的影响将有显著抑制作用的土三七提取液，进一步考察其对食管癌细胞的超微结构的影响。将土三七水提液用于食管癌细胞培养，细胞经常规戊二醛及锇酸双重固定和Epon 812包埋；超薄切片，常规铀—铅染色，电镜下观察食管癌细胞的超微结构的变化。二、应用前景1.该成果通过采用不同提取方法对土三七（景天三七）中总酚酸、没食子酸、多糖等成分进行了提取，并采用高效液相色谱法和分光光度法进行了含量分析。没食子酸提取结果：没食子酸含量分别为0.2604mg/g（甲醇）、0.2282mg/g（乙醇）、1.991mg/g（水），表明水提取没食子酸的效率最高。总酚酸的提取结果：总酚酸含量分别为50.29mg/g（甲醇）、44.14mg/g（乙醇）、42.47mg/g（水），表明甲醇的提取率最高。2.多糖提取条件优化，经统计学处理，提取温度、提取时间及溶媒倍数三个主效应均具有高度统计意义（P＜0.01）。3.该成果将野生型土三七进行组织栽培及培育，野生品和栽培品中总酚酸的含量比较表明，二者无显著性差异（P＞0.05）。4.不同溶剂提取液用于对食管癌细胞生长增殖影响，结果显示水提取液的抑制率最高，电子显微镜下观察显示，土三七对食管癌细胞超微结构有明显的破坏作用。该成果不仅对张家口地道药材土三七相关成分分析提供了可靠、稳定的方法，同时也为该药材广泛种植及该药材抗癌作用提供了实验依据，具有较大社会效益和较好的应用前景。