[01320373]中药降脂与细胞固醇调控系统的研究
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技术详细介绍
本项目从信号调控的角度探寻药物与信号调控途径中关键蛋白分子以及基因调节元件间的相互作用关系；利用肝HepG2细胞作为LDL受体基因表达检测系统，建立基因转化的HepG2细胞系，经中药干预培养后，分析中药对SREBP信号调控途径中调控因子的影响。
（1）建立4SRE-GFP基因转化的HepG2细胞系：将绿色荧光报告蛋白GFP基因构建在SRE-1序列的下游，获得pLXRN-4SRE-GFP质粒。用逆转录病毒转染系统Pantropic Retroviral Expression System建立HepG2/SREGFP细胞系。
（2）应用4SRE-GFP基因转化的HepG2细胞系对中药进行初选：以HepG2/SREGFP细胞系为实验材料，实验分组，设空白对照组、阳性对照组（LPDS）、中药组。在中药组的培养液中分别加入一定浓度的姜黄素、丹参酮、川芎嗪、茶多酚等中药成分。干预培养24小时后用荧光显微镜对各组进行观察，诱导GFP表达的药则可用下个系统进一步筛选和做药效评价。
（3）应用HepG2细胞系对筛选出的中药进行进一步药效评价：以未经转染的HepG2细胞系为实验材料，实验分组同上。
在中药组的培养液中分别加入不同浓度的姜黄素（经上述实验筛选出的中药成分）干预培养24小时后用检测LDL受体的表达水平。
建立的检测方法包括：
1.ELISA法，用自制的LDL受体多克隆抗体，作为一抗；用酶标二抗，显色后用酶标仪检测。
2.专一性的荧光标记探剂DiI-LDL，并用激光共聚焦扫描显微镜法和流式细胞仪可定量检测LDLR的活性。
3.用DiI-胶体金双标LDL，用电镜定性鉴别观察LDL受体的表达情况。
4.制备LDL受体多肽抗体，用Western-Blot检测LDL受体的表达情况。
5.Rt-PCR及实时荧光定量PCR检测LDLR mRNA的表达情况。