[01224847]一种创建金线莲多倍体资源的方法

课题来源与背景：金线莲（Anoectochilus roxburghii）即花叶开唇兰,是兰科开唇兰属的一种多年生草本植物,是我国传统珍贵药材,有清凉解毒,滋阴降火,消炎止痛等功效,常被用于糖尿病、高血脂、肝炎等慢性疾病的治疗,有“药王”、“金草”等美誉。目前,现有的金线莲均为二倍体,生长缓慢,株高仅5～10cm,产量很低,药效成分更低。植物多倍体化后根、茎、叶等营养器官变大,次生代谢物含量提高,因此培育多倍体金线莲是提高金线莲药材产量的途径之一。广西教育厅下达了“应用基因组多倍化与杂交育种相结合的方法培育三倍体金线莲研究”的科研项目,编号 YB2014315,项目执行时间2014年1月－2016年12月,项目总经费3万元（其中财政3万元）,承担单位为玉林师范学院。发明内容：本发明利用金线莲（Anoectochilus roxburghii）×血叶兰（Ludisia discolor）进行属间远缘杂交产生2n配子杂种后代的方法,通过亲本选配、远缘杂交、杂种群体构建、2n配子杂种后代的鉴定等步骤,实现了金线莲多倍体资源的创建,具体包括以下的工艺步骤：（1）亲本选配。在温室中选取生长健壮的金线莲（Anoectochilus roxburghii）作母本,血叶兰（Ludisia discolor）作为父本。（2）远缘杂交。对选择的亲本进行精心栽培管理,待亲本开花时用镊子取出金线莲当天开花花朵中的花粉块,将血叶兰的花粉块授于金线莲的蕊腔中。3)杂种群体构建。采收远缘杂交获得的成熟果实经消毒后用解剖刀纵向切开果实,将种子均匀撒于种子萌发培养基中进行种子萌发培养。当种子苗长高时转接至壮苗培养基中进行生根壮苗培养。待试管苗具有2条以上根时,将培养瓶盖子打开在室外无直射光的地方炼苗后取出试管苗移栽于由树皮、兰石、泥岩组成混合基质中,试管苗移栽后精心管理直至植株开花。（4）2n配子的鉴定。待植株开花后,采集植株新鲜成熟的花粉,采用直接压片法制片后于光学显微镜下观察2n花粉,统计2n花粉的发生频率。（5）2n配子杂种后代的筛选。对经步骤（4）鉴定的2n花粉发生率大于1%的植株进行分盆栽培,并经两年以上重复鉴定,筛选出发生率高且稳定的植株即为2n配子杂种后代。（6）2n配子杂种后代自交。对获得的2n配子杂种后代进行进行精心栽培管理,待植株开花后使其自然授粉。（7）多倍体资源的获得。采收自交获得的成熟果实经消毒后用解剖刀纵向切开果实,将种子均匀撒于种子萌发培养基中进行种子萌发培养。当种子苗长高时转接至壮苗培养基中进行生根壮苗培养。待试管苗长具有2条以上根时,将培养瓶盖子打开在室外无直射光的地方中炼苗,对试管苗采用根尖直接压片法制片后于光学显微镜下进行染色体计数,筛选多倍体植株。将筛选得到的多倍体植株移栽于由树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得金线莲多倍体资源。