[01133949]微生物发酵L-色氨酸代谢调控关键技术研究及产业化

国内生产L-色氨酸所采用的提取工艺主要是传统的“三膜法＋离子交换+活性炭脱色”,即“微滤膜除菌+超滤膜除杂+纳滤膜脱色”的三膜法提取工艺,后续还需要进行离子交换脱盐,活性炭脱色等繁杂工序。由于该工艺提取路线长,提取收率最高为80%,并且一次性投资大、能源耗量高、废水排放量大等,大大增加了运行成本。相对于传统分离工艺,色谱分离技术通过混合物中各组分在色谱分离柱中两相间不断进行着的分配过程实现分离,是目前最有效的混合物分离、分析方法。可以实现真正的连续、稳态运行。而且具备节省树脂用量、节省再生剂和洗涤水用量、工艺灵活性高、操作简单、投资费用低等优点。本项目针对我国L-色氨酸发酵工业中生产菌株性能差、发酵过程不稳定、副产物积累多、产酸水平及糖酸转化率低、提取收率低等主要问题,通过乙酸合成途径和谷氨酸合成途径的基因组学比较,定性筛选乙酸和谷氨酸合成关键基因,理性构建低乙酸及谷氨酸积累的菌株用于L-色氨酸发酵;进一步,基于代谢网络定量分析和单位细胞的色氨酸合成能力,理性调控溶氧及pH控制水平,并设计适宜细胞循环策略。另外,基于色氨酸发酵液全面分析,采用色谱与超滤耦合分离L-色氨酸。通过高性能生产菌株理性构建、发酵过程理性调控、细胞循环策略应用及耦合分离技术,可提高L-色氨酸产酸水平、糖酸转化率及提取回收率,实现L-色氨酸高效生产,显著降低L-色氨酸生产成本。 本项目基于目前我国L-色氨酸生产工业中的主要难题,通过生产菌株理性构建、发酵过程控制及细胞循环发酵、耦合分离技术等,显著提高了产酸水平、糖酸转化率及提取回收率,实现L-色氨酸的高效生产,主要形成如下技术成果： （1）基于L-色氨酸发酵过程分析和基因组学比较,结合乙酸及谷氨酸合成途径分析,定向改造乙酸与谷氨酸合成途径关键基因,理性构建乙酸及谷氨酸关键基因缺失菌株;基于过程分析与代谢流分布比较,选用重组菌株（TRTHPAB）进行L-色氨酸发酵,L-色氨酸产量及糖酸转化率分别为44.12 g/L、17.35%,较出发菌株分别提高了16.91%、21.16%。 （2）基于代谢网络定量分析,结合溶氧及pH水平对色氨酸合成的作用机制,根据不同溶氧水平与pH水平的L-色氨酸发酵分析与色氨酸合成代谢流分部,理性控制各阶段溶氧及pH水平,建立利于色氨酸合成的溶及pH控制策略;基于不同循环周期与循环比的发酵过程分析,建立L-色氨酸细胞循环发酵策略,且结合单个细胞色氨酸合成能力,解析色氨酸高效合成机制;L-色氨酸产酸水平及糖酸转化率分别提高至52.45 g/L、20%,发酵周期缩短至32 h。 （3）基于原子吸收色谱和三重串联四级杆液质联用系统对色氨酸发酵液的全面分析,结合色谱分离原理,合理树脂选型,建立色氨酸色谱分离工艺,并结合超滤工艺,建立L-色氨酸“色谱+超滤”耦合分离技术,L-色氨酸总收率由传统工艺的72%提高至95.04%。 本项目研究涉及菌株构建、发酵过程优化以及分离提取等方面,贯穿了生物发酵产业的上、中、下游,推动了生物发酵产业各个环节关键技术的快速发展。本项目通过菌株理性构建、发酵过程调控、以及耦合分离技术等,实现L-色氨酸高效生产;且项目L-色氨酸生产技术在宁夏伊品生物科技股份有限公司、河南巨龙生物工程股份有限公司得到工业化应用。同时,集成项目技术,成功应用于山东绿都生物有限公司、山东标准生物科技有限公司及清源生物（深圳）有限公司等多种发酵产品的工业化生产。因此,本项目技术在L-色氨酸生产及其他发酵产品的高效制备中具有通用性;结合生物发酵产业的转型升级,则本项目技术具有良好的市场应用前景。