[01085374]分子和细胞工程技术在怀地黄育种中的应用研究

任务来源：该项目是自选项目，始于1993年，至于2011年，但主要研究活动集中在2002年至今，是河南师范大学与温县农业科学研究所等单位在怀地黄育种基础上的横向联合项目。该项目研究过程中，先后得到河南洛阳华美生物工程公司博士后流动工作站、西北大学陕西省生物技术重点实验室、温县农业科学研究所、河南师范大学及其生命科学学院博士科研启动基金、河南省遗传学重点学科、河南师范大学研究生经费、国家高技术研究发展计划(863计划)项目(高产优质多抗林木花草分子与细胞高效育种技术及品种创制(2006AA100109)横向课题、河南省教育厅项目(怀地黄高效细胞育种技术的研究(2009B180016)和怀地黄新品系HW大田试验和示范推广(2011A180022))经费、河南省高校道地中药材保育及利用工程技术研究中心开放课题(怀地黄分子细胞育种技术研究与应用)基金的支持。应用领域和技术原理：地黄是大宗常用中药材，市场用量大，是近年来中药研究的热点之一，具有重要的药用价值、保健作用和经济价值。地黄在中国广泛分布，但以河南怀地黄品质最佳，疗效最优。地黄生产中长期使用无性繁殖与品种混杂造成品种退化、质量和产量下降是地黄生产中存在的主要问题。因此，研发有效的分子细胞育种技术对地黄品种进行改良和选育，提高其产量与质量，增强国际市场竞争力，非常迫切。该项目研究结果应用于地黄育种，对其他作物分子细胞育种也有一定参考价值。其技术原理是：发根农杆菌在感染植物体受伤部位或各种外植体的过程中，将其Ri质粒的T-DNA基因整合进入植物基因组，稳定表达，引起宿主植物发状根的形成与生长。然后，基于植物发状根细胞的全能性，经过组织培养再生转T-DNA基因植株，其T-DNA的插入导致的基因突变和组织培养过程中发生的体细胞无性系突变所引起的转基因植株某些性状的改变，可以用DNA分子标记技术在DNA分子水平检测出来。最后，淘汰突变株库中具有不良性状的突变体材料，筛选出具有优良性状的突变体材料，培育良种。性能指标：1.利用发根农杆菌15834菌株感染怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎切段，首次建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。用形态标记、HPLC化学 成分分析、T-DNA区基因的PCR、Southem blot分析及其表达产物的RT-PCR扩增检测和冠瘿碱纸电泳证明农杆菌Ri质粒上的T-DNA区的基因整合到怀地黄基因组中并表达，获得了T-DNA诱变怀地黄植株，建立了怀地黄毛状根及其再生植株的鉴定体系。2.建立了行之有效的T-DNA诱变怀地黄植株快速繁殖和移栽的技术体系以及T-DNA诱变怀地黄栽培技术体系，首次获得12个具有标记性状的突变体。3.对T-DNA诱变怀地黄植株及其品种(系)进行PCR和Southern blot检测结果表明T-DNA在其诱变怀地黄植株及其品种(系)基因组稳定存在。4.首次建立了怀地黄的SRAP和ISSR等多种分子标记方法，对现有23个怀地黄品种进行了遗传多样性分析，明确了其亲缘关系。进而建立了HW突变株系的SRAP分子标记鉴定体系，筛选出2个具有转化受体所不具有的特异DNA片段的株系。5.选育出的两个性状优良的怀地黄品种(系)HW-2和HW-4的梓醇含量由对照85-5的0.76%提高到1.35%和1.26%，均高远于中国药典2010年版一部的标准梓醇含量0.2%。而且其总糖含量和标志成分毛蕊花糖苷含量比对照85-5提高6.85%-7.82%和2.65%-5.5%；经过四点的示范、试种和推广，其产量分别比当前主栽品种(系)对照85-5和北京一号分别增加8.3%和12.6%，亩增收480和789元，具有较好的社会和经济效益。同类产品比较：国内外已有与该项目研究内容中DNA分子标记技术和发状根诱导及其植株再生的相关文献报道。其中地黄SRAP和ISSR分子标记技术以及怀地黄发状根再生植株技术由课题组首创。其他文献要么是综述性文章，介绍了RFLP、RAPD、ISSR及SRAP等几种常用分子标记的原理，对其在地黄研究中的应用进行了探讨，要么利用分子标记技术研究地黄居群多样性或地黄品种遗传多样性，或者地黄发状根诱导与培养，而该项目重点对地黄发根农杆菌介导的T-DNA基因遗传转化技术及其发状根再生植株、DNA分子标记(如SRAP和ISSR)技术进行了研究，建立了地黄发根农杆菌介导的T-DNA基因遗传转化技术和DNA分子标记技术相结合的综合育种技术，并将该技术用于怀地黄品种改良。河南省科学技术信息研究院2011年3月17日查新结果表明，在所列检索范围内，与该项目上述内容相同的怀地黄分子细胞育种技术研究，国内未见报道。该研究的突出特点是：1.有效综合了发根农杆菌介导的T-DNA基因遗传转化技术和DNA分子标记(SRAP)技术的优点。2.具有自然、安全、育种时间短、选择目的性强和育种成本低等优点。3.能够有效改良怀地黄性状和品质。技术的创新性和先进性：1.首次建立了怀地黄的SRAP和ISSR等多种分子标记方法，对现有23个怀地黄品种进行了遗传多样性分析，明确了其亲缘关系。2.利用发根农杆菌感染怀地黄外植体，优化了转化条件，建立了有效的毛状根培养及其植株再生技术体系，首次获得12个具有标记性状的突变体，并从中筛选出2个性状优良的新品种，具有较好的社会和经济效益。3.对T-DNA诱变怀地黄植株及其品种(系)进行PCR和Southern blot检测结果表明T-DNA在其诱变怀地黄植株及其品种(系)基因组稳定存在。作用意义：该研究利用现代植物生物技术的最新成果，研究怀地黄分子和细胞工程育种，选题准确，设计合理，技术新颖。分子和细胞工程技术在怀地黄育种上的应用是行之有效的，对实现怀地黄育种理论和关键技术的新突破、改良地黄品种、促进其产业与经济发展等具有重要意义。采用该技术选育的怀地黄良种(系)经过示范试种，测得其产量产量对照增产增加经济效益。另外，该育种技术对其他作物育种技术的研制和应用也有重要参考价值。推广应用的范围、条件和前景以及存在的问题和改进意见：该研究成果应用于地黄育种或者其他作物育种领域。该技术已经初步成功用于怀地黄品种改良和生产上，预计推广面积2万亩，可创经济效益1000万元以上，具有很好的应用前景。但是，该技术在地黄育种实践中需要研究与之相配套的栽培技术，以确保其高产高效安全。